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促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制(精)

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促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制 作者:王青, 王缦*, 魏东芝, 陈寒柏, 张黎明 作者单位:华东理工大学 生物化学与分子生物学系, 上海 200237; 上海科华生物工程股份有限公司, 上 海 200233 【摘要】 目的: 研制人血清中促甲状腺素(TSH)的化学发光免疫检测 试剂盒。方法: 采用辣根过氧化物酶标记的抗 TSHβ 亚单位特异性单克隆抗体 (mAb), 与固相包被的抗 TSHα 亚单位的另一 mAb 配对, 以鲁米诺作为底物, 采 用两步法建立了双位点夹心法人血清 TSH 的化学发光免疫定量分析法。结果: 该方法灵敏度为 0.0788 mIU/L, 批内 CV *均为 4.7%, 批间 CV *均为 8.4%, *均回收率为 93.05%。该检测与 LH、 FSH 和 HCG 无交叉反应。部分实验样品 的测试结果显示该试剂与国外同类试剂(雅培 architect i2000)的测定结果明 显相关(r=0.984)。结论: 该方法具有较高的灵敏度、 重复性和准确度, 与其 他同类产品相比简便、 快捷、 成本低, 适于临床检测和科研应用。 【关键词】 促甲状腺激素(TSH) 化学发光免疫分析法 试剂盒 促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, thyrotropin, TSH)是一种 由垂体前叶分泌的糖蛋白激素, 由 α 和 β 2 个亚基组成, 相对分子质量(Mr)为 28000[1]。TSH 本身受下丘脑分泌的 TSH 释放激素 TRH 的调控, TSH 的主要生理 作用是调节甲状腺激素的合成与分泌, *中甲状腺激素水*与腺垂体分泌 TSH 的量之间有负反馈抑制关系[2]。甲状腺功能改变时, TSH 的波动较甲状腺 激素更迅速且明显, 是反映下丘脑 垂体 甲状腺轴功能的敏感指标, 因此采 用灵敏度高的 TSH 免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析 (chemiluminescent immunoassay, CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法, 在免疫 诊断试剂研制中已得到了广泛的应用[3]。本研究根据化学发光免疫分析法的原 理研制了血清 TSH 的检测试剂盒, 与国内外同类产品相比具有简便、 快捷、 成本低等优点。 1 材料和方法 1.1 材料 TSH 单克隆抗体(mAb)、 TSH 标准品抗原和辣根过氧化物酶(HRP) 为 Sigma 公司产品, 光免板为 Thermo Electron 公司产品, 化学发光底物为 BioRad 公司产品。 1.2 方法 1.2.1 标准品的配制 将 TSH 抗原标定后溶于小牛血清中, 配制成含 0.1, 1, 5, 20, 100 mIU/L 的标准溶液。 1.2.2 抗体包被板的制备 将 100μ L 含 TSH mAb(0.5mg/L)的 pH9.6 碳酸盐 缓冲液加至包被板中, 37℃包被 2 h, 再用含 10 mg/L BSA 的 0.01 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液于 37℃封闭 2 h 后晾干备用。 1.2.3 酶标记物的制备 TSH 的酶标记物采用过碘酸钠法制备, 然后经 0.01 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液透析过夜后, 加入等量的甘油于-20℃保存备用。 1.2.4 检测方法 将 50 μ L 待测样品或标准品加入包被 TSH 的光免板中, 37℃温育 30 min, 弃反应液, 用洗涤液(含 0.5 mg/L Tween20 的 0.01 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液)洗 5 次, 加酶标记物 50 μ L, 37℃温育 30 min 后同样用 洗涤液洗 5 次, 然后加入发光底物于 5~10 min 内测定各孔的发光值 RLU。样 本中的 TSH 浓度依据由标准品 TSH 浓度和对应的 RLU 建立的数学模型进行定 量。 2 结果 2.1 动力学性质 在 HRP 鲁米诺 H2O2 发光体系中, 将不同量的免疫复 合物加入发光液中, 发光强度(RLU)随反应时间而变化。10 min 后 RLU 接*峰 值, 在 5~15 min 内 RLU 较为稳定, 随后开始缓慢下降。 2.2 反应条件优化 2.2.1 加样量对 RLU 的影响 样本和酶标记物的加样量分别为 50 μ L 和 100 μ L 考查标准品(0、 0.1、 1、 5、 20、 100 mIU/L)RLU, 发现加样量为 100 μ L 与 50 μ L RLU 相差不大, 说明 50 μ L 的加样量反应能达到*衡(图 1)。 图 1 加样量对 RLU 的影响(略) 2.2.2 反应模式对 RLU 的影响 采用二步法。第一步: 加入标准品和待测样 品后, 将反应体系在 37℃分别温育 15、 30、 45、 60 min; 第二步: 加入酶 标记抗体后, 将反应体系在 37℃分别温育 15、 30、 45、 60 min。结果表明 温育时间为 30 min 时反应皆能达到*衡(图 2)。 图 2 温育时间对 RLU 的影响(略) A: 第一步温育时间对 RLU 的影响; B: 第二步温育时间对 RLU 的影响. 2.3 稳定性 将试剂盒放置于 37℃ 6 d 后, 比较与放置前参考标准品各点 RLU 值, 参考标准品各点 RLU 值未见明显降低, 且本底发光值无明显升高, 表 明试剂盒标准曲线无明显漂移, 满足稳定性要求。 2.4 方法学评价 2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下, 以标准血清的 浓度(0~100 mIU/L)制作的标准曲线见图 3。同时测定 20 个零标准, 用零标准 均值加上 2 倍标准差, 计算出此方法的灵敏度为 0.0788 mIU/L。 图 3 TSH 标准曲线(略) 2.4.2 精密度 取低(4.44 mIU/L)、 中(19.45 mIU/L)和高(79.23 mIU/L)3 种 TSH 浓度各重复测定 10 次, 测定批内 CV


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